TAREA 4
ESTABLECER Y DESCRIBIR LAS TÉCNICAS DE SEPARACIÓN EMPLEADAS EN LA DETERMINACIÓN DE LOS ANALITOS

Las técnicas de separación se incluyen dentro de la primera etapa del proceso analítico, lo que conocemos como operaciones previas y estas tienen principalmente dos finalidades: sirven para mejorar la selectividad, eliminando las interferencias que puedan existir; y también sirven para mejorar la sensibilidad de manera indirecta, realizando una preconcentración de la muestra.
Para llevar a cabo este proceso necesitamos transferir nuestras muestras a una fase que nos facilite el análisis y con las técnicas de separación este trabajo es más sencillo.


ISOCIANATOS

En este caso para la separación usamos la cromatografía líquida de alta resolución, técnica de la que ya hablamos en la tarea 2. Para la separación y determinación de isocianatos analizamos la disolución obtenida en un cromatógrafo líquido de alta resolución equipado con detectores ultravioleta (UV) y electroquímico (EQ). Este procedimiento se debe realizar después de un proceso de preconcentración de la muestra, con lo que conseguimos una mayor sensibilidad del proceso analítico.


Cromatografía liquida de alta resolución (HPLC)

La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil.

La cromatografía líquida de alta eficacia o High performance liquid chromatography (HPLC) es un tipo de cromatografía en columna utilizada frecuentemente en bioquímica y química analítica, en ella la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene la fase estacionaria.

El compuesto pasa por la columna cromatográfica a través de la fase estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeñas partículas redondeadas con ciertas características químicas en su superficie) mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión a través de la columna.

La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna. El tiempo que tarda un compuesto en ser eluído de la columna se denomina tiempo de retención y se considera una propiedad identificativa característica de un compuesto en una determinada fase móvil y estacionaria, es decir, el grado de retención de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composición de la fase estacionaria y de la fase móvil

Para el estudio de isocianatos se recomienda una columna cromatográfica de 15 cm x 0,46 cm de diámetro interno, de sílice funcionalizada con C18 y partícula regular de 5 μm.

Las condiciones cromatográficas con esta columna son las siguientes:

• ELUYENTE

Para TDI y HDI: 40% de acetonitrilo, 60% de tampón de acetato de sodio y ajuste a pH 6 con ácido acético glacial.

Para MDI: 60% de acetonitrilo, 40% de tampón de acetato de sodio y ajuste a pH 6 con ácido acético glacial.

(Se habla del TDI, HDI y MDI en la tarea 1)

• CAUDAL

1 ml/min

• DETECTORES

UV a una longitud de onda de 242 nm. EQ a un potencial de oxidación de + 0,8 eV (electrodo de plata-cloruro de plata).


Video esquemático sobre el funcionamiento del HPLC



También existen otras técnicas de separación como podemos ver en el siguiente ejemplo donde se relata el procedimiento a seguir para separar el isocianato de metilo de una mezcla que se encuentra en fase gaseosa, y que contiene isocianato de metilo y vapor de agua:
1. Separar una porción del vapor de agua enfriando la mezcla a una temperatura superior al punto de rocío del isocianato de metilo contenido en la mezcla, para que se condense el vapor de agua.
2. Separar esencialmente todo el vapor de agua remanente de la mezcla en fase gaseosa, adsorbiendo el vapor de agua de la mezcla.
3. Licuar el isocianato de metilo.



ESTIRENO

Para el análisis de estireno podíamos seguir dos métodos distintos de los que hablamos en la tarea 2, en este caso la técnica de separación usada es la cromatografía de gases, que en el segundo método debía estar equipada con un detector de ionización en llama.


Cromatografía de gases

Este método se usa para la separación de sustancias volátiles térmicamente estables. Esta técnica proporciona una resolución y sensibilidad muy elevadas. La única limitación es la temperatura de trabajo que se sitúa en torno a los 450º C, temperatura a la cual muchos solutos se volatilizan.
En cromatografía de gases las sustancias se separan por distribución entre una fase estacionaria, que suele ser un sólido o un líquido inmovilizado en otro sólido o en las paredes de la columna; y la fase móvil que es gaseosa.

En una separación se parte de la base, de que cada componente será disuelto o adsorbido por la fase estacionaria. Los distintos componentes serán retenidos por esta fase con mayor o menor fuerza y alcanzarán el final de la columna, donde se encuentra el detector, después de un tiempo más o menos largo.
La cromatografía de gases permite obtener resultados cualitativos y cuantitativos.

Actualmente existen muchos modelos distintos de equipos para cromatografía de gases. En las últimas décadas, los instrumentos que han aparecido presentan muchos cambios y mejoras.


Componentes básicos

- GAS PORTADOR: es el que transporta los componentes de la muestra y crea una matriz adecuada para el detector. Un gas portador debe: ser inerte para evitar interacciones (tanto con la muestra como con la fase estacionaria), ser capaz de minimizar la difusión gaseosa, ser fácilmente disponible y puro y ser económico y adecuado para el detector que utilizamos.

- COLUMNAS DE SEPARACIÓN Y FASES ESTACIONARIAS
Si la fase estacionaria es una sustancia sólida, esta modalidad de la GC se denomina cromatografía gas-sólido (GSC).
Si la fase estacionaria es un líquido no volátil (viscoso), se denomina cromatografía gas-líquido (GLC). La GLC es la más versátil y se usa mucho ya que permite trabajar con compuestos gaseosos (de peso molecular bajo).

- SISTEMA DE INYECCIÓN DE LA MUESTRA: La muestra debe introducirse rápidamente en la columna. Normalmente, los líquidos se introducen en la columna por medio de jeringuillas de inyección (jeringuillas de microlitros) a través de una membrana de goma del inyector termostatizado y los componentes se vaporizan.
La cantidad de la muestra a utilizar depende del tipo de columna, de la cantidad de fase estacionaria que contiene la columna, del espesor de la película (en el caso de capilares de película fina), de la solubilidad de los componentes importantes en la fase estacionaria y de la temperatura.
Controlando los cambios de temperatura de la columna se puede alcanzar el intervalo de temperatura óptimo para cada componente y así obtener para cada uno de ellos picos claros y completamente separados en el caso ideal.

- DETECTORES
El detector es un dispositivo capaz de convertir una propiedad física, no medible directamente, en una señal que nos ofrece información sobre la naturaleza y magnitud de la propiedad física.
En cromatografía el detector funciona comparando una propiedad física entre el gas portador puro y el mismo gas portador con cada uno de los componentes que previamente se han separado en la columna, esta acción se traduce en una señal eléctrica, que posteriormente se amplificará mediante un registrador o integrador gráfico que nos indica el momento en que salen de la columna los componentes.

Muchas veces se usa un detector que es el detector de ionización de llama (FID). En él se mide, registra y amplifica el flujo iónico que resulta de la ionización de las moléculas en una llama de hidrógeno. Este detector depende del flujo de masa, es decir, la señal es mayor, cuánta más sustancia se ioniza en la llama por unidad de tiempo.

EXPLICAR EL OBJETIVO DE INCORPORAR LAS TÉCNICAS DE SEPARACIÓN

Como ya se dijo las técnicas de separación tienen dos objetivos fundamentales que son mejorar la selectividad y al mismo tiempo mejorar la sensibilidad.
Gracias a las técnicas de separación podemos mejorar directamente la selectividad, ya que estas eliminan las interferencias, así nos deshacemos de otros elementos que puedan existir en nuestra muestra y que nos puedan modificar la señal que debemos recibir. De la misma manera podemos mejorar de manera indirecta la sensibilidad, al realizar una preconcentración de la muestra obtendremos mejores resultados en nuestro análisis.
Como se describe en el punto anterior la cromatografía, que es la técnica usada en ambos casos, aunque con variaciones; es una técnica que nos permite obtener una elevada selectividad y sensibilidad, ofreciéndonos así resultados precisos.

TAREA 3 .

PREPARACIÓN DE MUESTRAS

Una muestra es una porción de un objeto donde se investiga un analito.
El objeto del proceso de muestreo es encontrar una muestra que transmita la información real del objeto. La muestra que usamos debe ser representativa, debe poseer las mismas propiedades y características que tiene el objeto completo del cual se obtiene. Así mismo esta debe conservar sus propiedades durante el análisis y el transporte y presentar un tamaño razonable que nos permita trabajar bien con ella.
En nuestro caso debemos describir las etapas de preparación de dos muestras que son el estireno y los isocianatos que pueden estar presentes en el aire, por lo tanto las dos muestras con las que trabajamos se encuentran en estado gas.


ISOCIANATOS
Para obtener una muestra de isocianatos en el aire debemos usar ciertos materiales y aparatos como son las bombas de muestreo, frascos borboteadores de vidrio y tubos de vidrio de tapón enroscado y junta de politetrafluoroetileno (PTFE). La bomba y el borboteador se tienen que conectar con un tubo de longitud y diámetro adecuado para evitar pérdidas.

En el proceso de toma de la muestra debemos seguir varios pasos que describimos a continuación.
1. Calibrar la bomba de muestreo conectada a los borboteadores en condiciones representativas de la toma de muestra, utilizando un medidor de caudal externo. El caudal debe ajustarse en función del volumen de aire y el tiempo de muestreo escogido y debe comprobarse antes y después del muestreo.
El volumen de muestreo recomendado es de 30 litros para un período de muestreo de 8 horas. En períodos de muestreo más cortos se puede aumentar el caudal, pero este no debe exceder de 1 I/min. Si la diferencia de caudales es superior al 10% del caudal inicial debe rechazarse la muestra. Se anotan la temperatura y presión ambientales durante la calibración de la bomba de muestreo.
2. La muestra se toma a través de un tren de tres borboteadores en serie, dos con 10 ml de disolución absorbente (que es la disolución de 1-(2-metoxifenil) piperacina diluída 10 veces con tolueno) y el tercero, que está vacío para evitar que pase disolución a la bomba en caso de que se produzca un accidente.
3. Es aconsejable usar una trampa de carbón activo después de los borboteadores, para evitar que pase vapor de tolueno de la disolución absorbente a la bomba.
4. El aire a muestrear no debe pasar por ningún conducto antes del tren de borboteadores.
5. Si hay algo de evaporación de la disolución absorbente durante el muestreo, hay que añadir tolueno hasta obtener de nuevo los 10 ml.
6. Hay que anotar y registrar los tiempos, temperatura, caudal y presión barométrica antes y después de la toma de muestras.
7. Finalizado el muestreo, debemos desconectar la bomba, retirar los borboteadores y trasvasar el contenido de cada uno de ellos a un tubo de vidrio con tapón roscado. Lavamos el borboteador con un pequeño volumen de tolueno y lo añadimos al tubo correspondiente.
8. Con cada lote de muestras debe utilizarse un borboteador que se someterá a las mismas manipulaciones que los borboteadores de muestreo, aunque en este caso no se hará pasar aire a su través y este será considerado el blanco.
9. Los tubos se enviarán al laboratorio sin que se produzcan pérdidas de contenido y evaporación del tolueno.
10. Es aconsejable analizar las muestras en poco tiempo y almacenarlas refrigeradas mientras no son analizadas. Para períodos de demora superiores a 24 horas se recomienda almacenar las muestras evaporadas.

Preparación de muestras
Las muestras, una vez recogidas se acetilan con 2 gotas de anhídrido acético para mejorar la resolución cromatográfica de los derivados y del exceso de reactivo.
Las disoluciones de los tubos se evaporan mediante una corriente de nitrógeno para secarlas y el residuo obtenido se disuelve en 1 ml de la disolución diluyente (disolución al 0,5% (V/V) de anhídrido acético en acetonitrilo).
Los blancos se tratarán de la misma forma que las muestras.

Preparación de patrones
Los patrones se preparan a partir de los derivados de los isocianatos mediante las diluciones pertinentes con la disolución diluyente. Se prepararán, al menos, cinco disoluciones patrón que cubran el intervalo de concentraciones de las muestras a analizar. La concentración de los patrones se expresa en miligramos de isocianato por mililitros de disolución absorbente.
La determinación de patrones, de muestras y de blancos se efectúa por triplicado.



ESTIRENO
En el caso del estireno en primer lugar hablaremos de la toma de muestra siguiendo el método de captación con muestreos pasivos por difusión y desorción térmica. Después hablaremos de la determinación de estireno en el aire siguiendo otro método que es la captación en tubo adsorbente y desorción térmica.
El procedimiento a seguir se describe a continuación.

Método 1
1. Colocar el muestreador cerca de la zona de respiración siguiendo las instrucciones específicas del modelo utilizado.
2. Terminado el periodo de captación, desmontar el cabezal de difusión y colocar en su lugar el tapón de transporte, asegurando que sea buen hermético.
3. Anotar todos los datos de referencia y el momento de inicio y de final del muestreo. Hay que anotar también la temperatura, la humedad y otros datos de interés desde el punto de vista higiénico.
4. En el transporte, las muestras no deben someterse a temperaturas altas y tampoco contactar con productos que puedan contener componentes orgánicos volátiles.
5. En las condiciones adecuadas, el almacenamiento durante dos semanas a temperatura ambiente no produce pérdidas significativas. El almacenamiento durante periodos mayores deberá comprobarse previamente y en cualquier caso es recomendable realizarlo refrigerado.

Condiciones de desorción térmica
La desorción se realiza en dos etapas. En la primera, los vapores de estireno son conducidos desde el tubo situado en el horno de desorción hasta la trampa fría. Y en la segunda etapa se calienta la trampa fría para conducir los vapores directamente hasta el cromatógrafo de gases.

Preparación de muestras y blancos
Hay que sustituir los tapones de transporte o almacenamiento de los tubos por los cabezales estándar de desorción, teniendo cuidado al colocarlos. Siguiendo las instrucciones del sistema de desorción, debemos realizar este proceso en sentido contrario a como hemos realizado la adsorción.
La preparación de tubos patrón se realiza por triplicado. Los tubos patrón se analizan en las mismas condiciones que las muestras.


Método 2
En este caso debemos tener en cuenta que la determinación de estireno se realiza en una muestra de aire exhalado.
Para obtener la muestra seguimos estos pasos:
1. Insertar el tubo adsorbente en el sistema de captación, asegurando su cierre totalmente hermético.
2. Después que el individuo al que se tomará la muestra realice dos o tres respiraciones profundas y seguidas, deberá mantener el aire de la última inhalación unos 10 o 15 segundos antes de realizar una exhalación prolongada y total a través del tubo de aluminio del sistema de captación. El ritmo de esta exhalación debe ser lento y continuado.
3. Una vez finalizada la exhalación se hacen pasar por el tubo adsorbente y con una jeringa, 4 alícuotas de 50 ml cada una.
4. Se muestreará un volumen total de aire exhalado de 1 litro, que es el volumen de muestra recomendado en condiciones normales.
Si las concentraciones son muy bajas, se pueden muestrear volúmenes de aire exhalado mayores, repitiendo el procedimiento descrito las veces necesarias.
5. Para calcular el volumen total de aire exhalado que circula por cada tubo adsorbente, se toma nota del volumen de la jeringa, del número de alícuotas tomadas en cada exhalación y del número de veces que se repite el procedimiento completo sin cambiar el tubo adsorbente (en caso de que repitamos el procedimiento varias veces).
6. Terminado el muestreo se tapan ambos extremos del tubo adsorbente asegurando la hermeticidad del mismo.
7. En el transporte, las muestras no deben someterse a temperaturas elevadas ni contactar con productos que puedan contener componentes orgánicos volátiles.
8. En las condiciones adecuadas, el almacenamiento durante dos semanas a temperatura ambiente no produce pérdidas significativas.
El almacenamiento durante períodos mayores deberá comprobarse previamente y en cualquier caso es recomendable realizarlo en refrigerador.

Preparación de muestras y blancos
Debemos sustituir los tapones de transporte de los tubos por los cabezales de desorción estándar, teniendo cuidado de colocarlos de tal forma que, siguiendo las instrucciones específicas del sistema de desorción, ésta se realice en sentido contrario a como se realizó la adsorción.
La preparación de tubos patrón se realiza por triplicado.